Producción Biotecnológica de Hidrógeno y Uso de Foto Bioreactores

REINHARDT ACUÑA TORRES

 

Introducción

En anteriores artículos quedo demostrado que la producción de biocombustibles a partir de microalgas es la mejor alternativa ecológica frente a la producción de combustibles fósiles. A pesar del beneficio ecológico, siempre existe un porcentaje de emisiones de carbono (CO2) que no se recupera con el secuestro de carbono por parte de las microalgas. El hidrógeno es un gas combustible 100% ecológico (su combustión produce vapor de agua) que también puede ser producido biológicamente por diversos microrganismos y utilizando distintas vías metabólicas. Así entonces, la producción biológica de hidrógeno se realiza en diferentes bioreactores según sea el bioproceso metabólico realizado y el tipo de microrganismo utilizado.

 

Producción Biológica de Hidrógeno (Biohidrógeno)

Existen cuatro bioprocesos metabólicos por los que puede producirse biológicamente el hidrógeno:

•  Biofotólisis del agua (Directa e Indirecta)
• Fotofermentación
• Water-shift reaction biológica
• Fermentación oscura

Tabla 1. Reacciones generales implicadas en la producción de bio-hidrógeno

Proceso	Reacción General	Microrganismo
Biofotólisis Directa: Fase Luminosa	2H2O + luz → 2H2 + O2	Microalgas, Cianobacterias
Fotofermentación	CH3COOH + 2H2O + luz → 4H2CO2+2	Bacterias Púrpuras, Microalgas
Biofotólisis Indirecta: Reacciones de la Fase Oscura (a,b,c)	(a) 6H 2O + 6CO2 + luz → C6H12O6 + 6O2 (b) C6H12O6 + 2H2O → 4H2 + 2CH3COOH + 2CO2 (c) 2CH3COOH + 4H2O + luz → 8H2 + 4CO2	Microalgas, Cianobacterias
En general la reacción: 12H2O + luz → 12H2 + 6O 2
Water-Shift Reaction	CO + H2O → CO2 + H 2	Microrganismos fermentativos, bacterias fotosintéticas
Fermentación Oscura en Dos Fases: H2 + CH4	(a) C6 H12O6 + 2H2O → 4H2 + 2CH3COOH + 2CO2 (b) 2CH3COOH = 2CH4 + 2CO 2	Microrganismos fermentativos, bacterias metanogénicas
Fermentación Oscura de alto rendimiento	C6 H12O6 + 6H2O → 12H2 + 6CO 2	Microrganismos fermentativos

 

Enzimas Hidrogenasa y Nitrogenasa

Todos los bioprocesos metabólicos de la biofotólisis están controlados por enzimas que producen hidrógeno; de cuales existen dos tipos: hidrogenasa y nitrogenasa.

Las hidrogenasas existen en la mayoría de los microrganismos fotosintéticos y se clasifican en dos categorías:

1. Hidrogenasas de captación o irreversibles

2. Hidrogenasas reversibles.

Producción de Hidrógeno mediada por la Hidrogenasa

Las hidrogenasas de captación actúan únicamente como catalizadores para el consumo de hidrógeno; por eso son irreversibles. Las hidrogenasas reversibles como su nombre lo indica, tienen la capacidad tanto de producir hidrógeno como de consumirlo, en función de las condiciones de reacción y de iluminación.

La hidrogenasa reversible es la enzima responsable de la producción de hidrógeno, catalizada por la siguiente reacción:

2H ⁺ + 2X_red ↔ 6H₂ + 2X_oxd El portador de electrones (X) usualmente es la ferredoxina (Fd) esta se reduce con el agua como donador de electrones por la reacción fotoquímica de la biofotólisis.

Producción de Hidrógeno mediada por la Nitrogenasa

Las nitrogenasas son responsables de la fijación del nitrógeno, se distribuyen principalmente entre los procariotas (incluyendo cianobacterias) y no se producen en las células eucariotas (bajo las cuales se clasifican microalgas). El nitrógeno molecular se reduce a amoniaco por el consumo de poder reductor (mediado por ferredoxina) y ATP. La reacción es sustancialmente irreversible y produce amoníaco:

N2 + ​​6H1⁺ + 6e^– 2HN₃

12ATP 12 (ADP + Pi)

Luego, en una reacción secundaria la nitrogenasa cataliza la reducción de protones en la ausencia de nitrógeno

2H⁺ + 2e^– H₂

Esquema del mecanismo fotosintético que genera poder reductor (NADPH) y ATP para la posterior fijación de CO2

4ATP 4 (ADP + Pi), atmósfera de argón.

La nitrogenasa es extremadamente lábil en presencia de oxígeno gaseoso; a diferencia de, la hidrogenasa, que lo produce. Sin embargo, las cianobacterias han desarrollado mecanismos de protección de nitrogenasa del gas oxígeno. Otros factores son: el alto suministro de energía ATP dependiente y la reducción de potencia. Para contrarrestar todas estas deficiencias los microrganismos han desarrollado diferentes mecanismos; el mecanismo más exitoso es la localización de la nitrogenasa en los heterocistos de las cianobacterias filamentosas; durante la fotosíntesis oxigénica, los compuestos orgánicos producidos por la reducción del CO2, se transfieren a los heterocistos y se descomponen para proporcionar nitrogenasa con la reducción de potencia (se genera poder reductor); el ATP es proporcionado por la PSI-dependiente dentro de heterocistos en la fotosíntesis anoxigénica.

Biofotólisis del Agua

Esquema de la Biofotólisis

La biofotólisis es la foto disociación del agua por microrganismos vivos; es decir, la disociación de agua en hidrógeno y oxígeno utilizando la energía solar y microrganismos fotosintéticos (microalgas verdes y cianobacterias); la reacción global es: H2O + 2H+ —> H2 + 1/2(O2) + 2H+; G° = 238 kJ/mol. Los microrganismos capturan la energía de la luz a través de sus clorofilas y pigmentos fotosintéticos. Estos últimos, son los encargados de absorber los fotones (partículas de luz) y generar el poder oxidante (gradiente de protones) capaz de descomponer el agua en protones (H+) y electrones (e-) y oxígeno gaseoso (O2) en el proceso iluminado de biofotólisis directa.

Los electrones producidos generan un gradiente que favorece la reducción de la ferredoxina (Fd) y de otros intermediarios energéticos en la fotosíntesis. Ese poder reductor es utilizado para reducir el CO2 hasta la formación de carbohidratos (almidón en microalgas y glicógeno en cianobacterias) y lípidos (usados para crecimiento celular y como reserva energética y de sustrato); como parte del metabolismo celular de los microrganismos. A partir de estos sustratos metabólicos (metabolitos) los diferentes microrganismos pueden producir hidrógeno (H2) por biofotólisis indirecta.

Los microrganismos generan hidrógeno por dos razones:

1. Para eliminar el exceso de equivalentes reducidos,

2. Como bioproducto de la fijación del nitrógeno.

La producción de H2 mediante biofotólisis (directa o indirecta) depende de la presencia o ausencia de luz. La biofotólisis directa se lleva a cabo bajo una radiación luminosa; en tanto que la indirecta, en la oscuridad.

Esquema de la Biofotólisis Directa

Biofotólisis Directa

En la biofotólisis directa se eleva el nivel energético de los electrones del agua y enseguida ocurre de manera simultánea, la desintegración del líquido y la transferencia de electrones a la Fd, produciéndose de manera continua H2; no obstante, este no es utilizable como fuente de hidrógeno, ya que, sirve como almacén de una parte de la energía proveniente de la luz. Las cianobacterias filamentosas utilizan la enzima nitrogenasa para realizar la biofotólisis directa, mientras que, las microalgas unicelulares utilizan la enzima hidrogenasa reversible para realizar el mismo bioproceso. Se generan 2 moles de H2 por cada mol de O2 liberado, siendo las microalgas unicelulares las mejores productoras de H2 por esta vía (Brentner et al., 2010).

Biofotólisis Indirecta

Bajo condiciones especiales de oscuridad y ausencia de oxígeno (anoxigenia) la ferredoxina puede ser utilizada por las enzimas hidrogenasa y/o nitrogenasa para reducir protones y generar hidrógeno molecular: 2H+ + 2〖Fd〗– ↔ H2 + 2Fd. La biofotólisis indirecta consiste en la primera etapa de fotosíntesis útil para la acumulación de carbohidratos; los cuales son utilizados en una segunda etapa de fermentación oscura; en la que, se produce hidrógeno, a partir de estos (carbohidratos).

Producción de Hidrógeno por Biofotólisis Indirecta

Esquema del mecanismo de producción de bio-hidrógeno de la cianobacteria Cyanothece 51142 por medio de energía solar y CO2 atmosférico. El CO2 se fija durante el día para sintetizar glucógeno que sirve como una reserva de energía y la fuente de electrones para la producción de H2 por la noche.

Una cepa de un microrganismo marino de fijación de nitrógeno Cyanothece 51142 ha demostrado ser la forma más eficiente de producción de bio-hidrógeno hasta la fecha. Cyanothece 51142 es capaz de producir hidrógeno aeróbicamente ya que, controla sus procesos metabólicos por un reloj circadiano interno. Fotosintetiza durante el día y almacena carbono (CO2) como glucógeno; pero por la noche, realiza la fijación de nitrógeno mediante el glucógeno obtenido como fuente de energía y utilizando la nitrogenasa para convertir N₂ a NH₃ con H₂ como subproducto. Aun cuando, el oxígeno esté presente, las altas tasas de respiración de Cyanothece son capaces de crear un ambiente anaerobio dentro de las células que permiten a la nitrogenasa poder funcionar. Biotecnológicamente se ha encontrado que para optimizar la producción de hidrógeno, las cianobacterias producen más si se cultivan en presencia de fuentes de carbono adicionales; siendo el glicerol, la más efectiva; con la enorme ventaja de que también es un producto de desecho de la producción industrial de biodiésel.

Mecanismos Combinados

Esquema de producción combinada de hidrógeno Alga: Bacteria Fotosintética

Mecanismos Combinados de Biofotólisis

Como parte de su esquema evolutivo y adaptativo, los micro-organismos generan el H2 y el O2 de manera separada y utilizando diferentes espacios y distintos tiempos. La finalidad es proteger las enzimas hidrogenasa y nitrogenasa de la acción del oxígeno; sobretodo la enzima hidrogenasa que es sumamente sensible a ese gas. Las cianobacterias y microalgas unicelulares utilizan ciclos de luz-oscuridad para proteger a las hidrogenasas reversibles; mientras que, las cianobacterias filamentosas, dado que son fijadoras de nitrógeno, poseen células especializadas (heterocistos) que son impermeables al O2 y que protegen a las nitrogenasas. Teniendo en cuenta que las microalgas son capaces de generar hidrógeno, produciendo ácidos orgánicos mientras que, las bacterias fotosintéticas, necesitan dichos ácidos orgánicos para la síntesis de hidrógeno; entonces, resulta lógico combinar ambos procesos de tal forma que, las microalgas generan hidrógeno y ácidos orgánicos o alcoholes de forma anaerobia, en la oscuridad, a partir de la materia orgánica presente ; de forma que, las bacterias fotosintéticas puedan emplear dichos compuestos orgánicos, para generar hidrógeno en condiciones de iluminación anaerobia. En este sentido, se debe implementar un sistema en dos fases. La Tabla 2 muestra un esquema general de las reacciones bioquímicas involucradas en la producción de H2 mediante estos mecanismos.

Tabla 2. Mecanismos de producción de bio-hidrógeno

 

Biofotólisis y Bioprocesos

A pesar de la alta eficiencia de conversión del sustrato y la elevada pureza del H2 producido (99.5%) mediante biofotólisis (Brentner et al., 2010) es necesario mejorar los rendimientos de productividad de los bioprocesos fotoquímicos, principalmente debido a la baja eficiencia fotoquímica que presentan la mayoría de los microrganismos fotosintéticos, en relación a la biofotólisis y la producción fotoquímica de hidrógeno. El problema se ha resuelto parcialmente diseñando fotobioreactores que permitan la adecuada penetración de la luz y la transferencia de energía entre las células y hacia los sistemas fotosintéticos relacionados.

También se investiga el uso de cepas mutantes de microalgas y cianobacterias; o el desarrollo de cepas transgénicas, a las cuales, por ingeniería genética, se les ha inhibido el funcionamiento de los complejos cosechadores de luz con la finalidad de mejorar el rendimiento del quantum fotosintético.

Con ingeniería metabólica se han diseñado cepas de cianobacterias deficientes de los genes que codifican para la hidrogenasa de respuesta, y con la capacidad aumentada de almacenaje de glicógeno (Brentner et al., 2010; Yu y Takahashi, 2007).

 

Diagrama propuesto para la generación de biohidrógeno por fotobioreactores de dos etapas.

Además, la sensibilidad de las hidrogenasas de microalgas al O2, se ha disminuido utilizando fotobioreactores de dos etapas:

1) Etapa 1 Aeróbica: en la primera etapa se produce la biomasa y se fotosintetiza (lumínica)

2) Etapa 2 Anaeróbica: en la segunda se produce H2; ésta se realiza en la oscuridad, al mismo tiempo que se mantiene con privación de azufre, lo que inhibe la producción de oxígeno.

 

Diseño del Bioproceso de Biofotólisis Indirecta

A nivel conceptual el diseño del bioproceso para la producción de biohidrógeno debe tomar en cuenta las siguientes operaciones:

1. Crecimiento de las microalgas o de las bacterias fotosintéticas

2. Concentración celular

3. Inducción de la hidrogenasa o la nitrogenasa

4. Control y Regulación del Fotoperiodo

5. Producción de Biohidrógeno en Foto Bioreactor

6. Operación Continua

 

1. Crecimiento de las microalgas o de las bacterias fotosintéticas

El crecimiento de la biomasa (microalgas o bacterias fotosintéticas) consiste en cultivar las microalgas o las bacterias fotosintéticas en estanques abiertos o lagunas y suministrarles los adecuados y requeridos nutrimientos para que se realice el proceso natural de fotosíntesis. La ecuación cinética de crecimiento de los microrganismos bacterianos, se rige mediante una reacción autocatalítica (reacción de primer orden): Donde: X =  concentración de biomasa, kg/m³;  t = tiempo, h;  µ = tasa específica de crecimiento, h^-1.  La tasa específica de crecimiento puede ser modelada según el Modelo Conjunto de Primer Orden y Orden Cero (Cinética de Blackman): µ = K_II Donde: µ = µ_max;  cuando I>I_s e I<I_s, respectivamente. Recordando que la hidrogenasa es inhibida en presencia de oxígeno, el Modelo Hiperbólico Rectangular (similar al modelo de Monod y de Michaelis-Menten) es el que debe aplicarse para cinética enzimática: Donde: µ = tasa específica de crecimiento, h^-1;  µ _max = tasa específica máxima de crecimiento, h^-1;  I = intensidad de la luz, W/m²;  K_I = coeficiente de saturación (modelo Monod) para la intensidad de luz, W/m². Alternativamente se puede aplicar el Modelo de Bannister: Donde µ es un factor de corrección empírico para el modelo. O el Modelo de Aiba: Donde K_i corresponde a una constante de inhibición, m²/W. El modelo de Aiba es el modelo más utilizado por simplicidad y adecuada descripción del comportamiento cinético de los microrganismos fotosintéticos; corresponde a un modelo tipo Monod, y puede ser fácilmente corregido para incorporar el efecto de inhibición mostrado por los cultivos frente a altas intensidades de luz. Para efectos de estudio, se ha considerado como ejemplo práctico una cinética de crecimiento tipo Monod, en que el sustrato limitante corresponde a la intensidad de la luz y para el que el coeficiente de saturación K_I y la tasa máxima de crecimiento específico, puede ser obtenidos gráficamente, utilizando los datos reportados por Janssen et al. (2000) que son presentados en la Figura 1.

Figura 1 Tasa de crecimiento específico (µ) de Chlamydomonas reindhardtii como función de iluminación continua de distintas densidades de flujo de fotones (PFDs)

A partir del gráfico presentado puede obtenerse:   Chlamydomonas reindhardtii, al igual que la mayoría de los microrganismos fotosintéticos, responde a la luz de acuerdo a la ecuación: I(d) = I_o exp(-eXd) que describe la absorción de una luz incidente de intensidad I₀ a una profundidad d en el reactor. Donde:  I(d) = intensidad de la luz absorbida a una profundidad d, W/m²;  I₀ = intensidad de luz incidente, W/m²;  e = coeficiente de extinción, m²/kg;  X = concentración de la biomasa, kg/m³;  d = profundidad, m. Estrictamente, esta relación es válida sólo para luz monocromática; pero puede ser utilizada para luz policromática, si se corrige el coeficiente de extinción (al considerar su dependencia con la longitud de onda).

 

Relaciones con la Luz

Cuando la luz pasa a través de un cultivo denso, la intensidad de luz absorbida decae rápidamente conforme aumenta la profundidad del foto-bioreactor; a nivel de superficie, la intensidad de luz absorbida debería ser igual al de la luz incidente; sin embargo, gracias a su aparato fotosintético, los microrganismos fotosintéticos son capaces de utilizar un máximo de luz incidente (denominado intensidad de saturación I_s), mediante el uso de mecanismos especializados en sus fotosistemas.  Es = Ecuación de Bush corresponde a una razón corregida entre la luz aprovechada por el aparato fotosintético de las microalgas (I_s) y la luz incidente (I₀). Si la intensidad de luz incidente es mayor que la intensidad de saturación, la diferencia de energía se pierde como calor y el proceso disminuye la eficiencia.

 

2. Concentración Celular

Dado el gran volumen de líquido contenido en el cultivo celular y el microscópico tamaño de los microrganismos, es necesario concentrar la biomasa (separación líquido-sólido), a fin de evitar el sobredimensionamiento de los equipos en las etapas siguientes del proceso. La concentración de diseño del bioreactor debe ser óptima, de forma que permita una alta tasa de producción de biohidrógeno y un tamaño adecuado de los equipos (costo operacional versus costo de equipos). Si bien esta concentración no está especificada en la literatura, de acuerdo a Benneman (1998) debe ser entre 30-45 kg/m³. No obstante, estudios más recientes apoyan que se pueden obtener concentraciones 50 kg/m³ y mayores (hasta 50 kg/m³), manejando adecuadamente las condiciones de crecimiento y ambientales del cultivo microrganismos.

Fases de Crecimiento de Microalgas Fotosintéticas

Microalgas Fotosintéticas en Diferentes Fases de Crecimiento

 

3. Inducción de la Hidrogenasa y la Nitrogenasa

Una vez concentrada la biomasa, deben inducirse los mecanismos para que los microrganismos produzcan biohidrógeno por biofotólisis indirecta, mediante la activación de las enzimas hidrogenasa y nitrogenasa.

Inducción de la Hidrogenasa: la inducción de la hidrogenasa pasa por dos etapas; a saber:

Etapa Luminosa: de fotosíntesis, en donde se acumulan carbohidratos que se utilizarán en;

Etapa Oscura: o de fermentación oscura, en donde el cultivo debe ser sometido a condiciones de anaerobiosis y de oscuridad, que inducen la síntesis y actividad de la hidrogenasa.

Producción de Hidrógeno mediada por la Hidrogenasa

El biohidrógeno es producido por la hidrogenasa en la etapa luminosa, mediante la siguiente reacción: 2H ⁺ + 2X_red ↔ 6H₂ + 2X_oxd el portador de electrones (X) usualmente es la ferredoxina (Fd); ésta se reduce con el agua como donador de electrones por la reacción fotoquímica de la biofotólisis.

Inducción de la Nitrogenasa: la inducción de la nitrogenasa, también pasa por dos etapas: Luminosa y Fermentación Oscura; la diferencia estriba en que la nitrogenasa es extremadamente lábil en presencia de oxígeno gaseoso; a diferencia de la hidrogenasa que lo produce; es por eso que la fermentación oscura con la nitrogenasa, debe darse en condiciones estrictamente anoxigénicas y sin presencia de nitrógeno; esto es, en una atmósfera de argón.

Etapa Luminosa: en la etapa luminosa se el nitrógeno molecular se reduce a amoniaco por el consumo de poder reductor (mediado por ferredoxina) y ATP. La reacción es sustancialmente irreversible y produce amoníaco:

N2 + ​​6H1⁺ + 6e^– 2HN₃

12ATP 12 (ADP + Pi)

Producción de Hidrógeno mediada por la Nitrogenasa

Etapa Oscura: en una reacción secundaria la nitrogenasa cataliza la reducción de protones en la ausencia de nitrógeno

2H⁺ + 2e^– H₂

4ATP 4 (ADP + Pi) Eso es, en una atmósfera de argón.

 

4. Control y Regulación del Fotoperiodo

El fotoperiodo es el tiempo de exposición a los ciclos de luz/oscuridad a los que son sometidos los microrganismos fotosintéticos durante su cultivo. El control y regulación del fotoperiodo es de especial importancia para optimizar la producción de biohidrógeno ya que, como vimos, la biofotólisis se realiza en dos etapas: una iluminada donde se producen carbohidratos y una oscura donde se genera el hidrógeno. Para optimizar la producción de biohidrógeno es necesario determinar cual es el fotoperiodo óptimo; el cual varía según la especie de microrganismo.

Por ejemplo, para determinar el fotoperiodo optimo para la producción de hidrógeno por Chlorella vulgaris; se expuso el cultivo a cuatro patrones de luz diferentes: en la oscuridad durante 72 horas, en la oscuridad durante 24 horas antes de ser expuesto a la luz (intensidad de 120 μ mole/m2/s) durante 72 horas, expuestos a la luz durante 72 horas, y expuestos a la luz durante 24 horas antes de ser sometida a la oscuridad durante 48 horas. La última condición fue la que mostró la mayor producción de hidrógeno total (530 ± 5 ml/l de medio) y una tasa de liberación de hidrógeno máxima (34,8 ml/h/l). Además, los cultivos de células se inmovilizaron, el medio fue privado de azufre y se purgó con N2. El crecimiento durante 72 horas bajo condiciones de luz parcial fue esencial para que la producción de hidrógeno fuera continua y más enérgica. La adición de glucosa al medio azufre-deficiente, aumento de la producción de hidrógeno por 18 veces, bajo condiciones de luz parcial. Como conclusiones: para aumentar la productividad de hidrógeno es necesario:

• Determinar el fotoperiodo óptimo;
• Operar bajo condiciones de luz parcial;
• Un medio de cultivo líquido azufre-deficiente;
• Añadir una fuente de carbono alternativa.

 

5. Producción de Biohidrógeno en Foto Bioreactor

El dimensionamiento del bioreactor se efectúa de acuerdo a las siguientes relaciones:  Donde: t = tiempo de residencia característico para las microalgas, h;  t ^* = tiempo de residencia en el foto bioreactor, h;  V = volumen del foto bioreactor, m³;  V^* = volumen del foto bioreactor para la nueva situación, m³;  F = caudal a tratar, m³/h. El tiempo de residencia t determina la tasa específica de producción de hidrógeno mediante las siguientes relaciones:   Donde: t = tiempo de residencia;  P = producto (_H2);  q_p = tasa específica de producción de hidrógeno; X = biomasa. La producción de hidrógeno por biofotólisis indirecta como indica la ecuación (2) es un compromiso entre la concentración celular X y la capacidad biosintética de la misma (q_p). El concepto que resume ambos aspectos es el de productividad; esto es, la cantidad de producto obtenido dividido el tiempo necesario para obtenerlo. La productividad puede ser mejorada aumentando X, q_p o ambos; pero un gran aumento de X causa una disminución de q_p; por lo que, es necesario, encontrar una solución de compromiso para lograr la máxima productividad.

La Producción de Biohidrógeno en Foto Bioreactor debe transitar por los siguientes 4 pasos:

    

 

6. Operación continua

Una planta biotecnológica para producir hidrógeno (basada en el proceso de biofotólisis indirecta) requiere de un modelo de operación continua como el que se muestra en el diagrama. El dimensionamiento de los equipos asociados a las principales operaciones; así como, el de cualquier otro equipo, se sustenta en la realización de los respectivos balances de masa y energía. En base a estas consideraciones los balances de materia para X, S y P son:  En estado estacionario las concentraciones dentro del bioreactor permanecerán constantes en el tiempo, lo que significa igualar a cero las ecuaciones. De la primera y teniendo en cuenta que rX = µx, resulta: donde D es la velocidad de dilución. La relación F/V se denomina velocidad de dilución (D) y como se observa tiene como unidad la recíproca de tiempo (1/t). Así, la velocidad de dilución es el inverso del tiempo promedio de residencia (t) y es igual al número de veces que una cantidad de mezcla de reacción (X) equivalente al volumen del reactor (V) pasa a través del recipiente de reacción por unidad de tiempo. En estado estacionario (EE) las derivadas con respecto al tiempo son iguales a cero y la ecuación para la concentración celular tiene la solución:  

 

Formación de Producto:

En estado estacionario, la 3° ecuación se reduce a:  O bien a:  Donde P representa la concentración de producto en estado estacionario. Dependiendo de como sea la cinética de formación del producto será la forma de la curva P vs. D.

Efecto de la tasa de dilución en la producción de biomasa de Kluyveromyces marxianus.

DISEÑO DE REACTORES TUBULARES PARA LA ABSORCIÓN Y ADSORCIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS DENTRO DE LECHOS EMPACADOS, ENFOQUE TEÓRICO-PRÁCTICO

Reinhardt Acuña Torres

 

Introducción

Existe un área en el diseño de bioreactores que está en el limbo entre los reactores químicos y los biológicos. Se trata del diseño de reactores o bioreactores (pueden ser ambos) para la absorción (separación) y adsorción (atracción) de compuestos bioactivos (biocompuestos) obtenidos de extractos vegetales crudos.

El bioreactor puede ser:

1. Un híbrido entre un reactor tubular tipo flujo pistón (RFP) y una columna cromatográfica de absorción.

2. Un híbrido entre un reactor tubular tipo lecho empacado (RLEP) y una columna cromatográfica de afinidad.

El propósito de utilización del bioreactor es separar los diferentes componentes activos de una mezcla de extractos crudos de origen vegetal en sus componentes individuales o metabolitos (secundarios) para su posterior purificación y/o procesamiento.

El proceso de separación es físico-químico:

1. Por adsorción química; utilizando el método de afinidad molecular o iónica, en una columna cromatográfica de afinidad.

2. Por absorción química; utilizando el método de exclusión molecular por gradiente de elución, en una columna cromatográfica de absorción.

Análisis Dimensional y Similitud Hidrodinámica:

El análisis dimensional tiene como propósito práctico la creación de modelos reducidos para su estudio y consideración sobre la influencia de posibles cambios en el modelo. Su aplicación se basa en formulación de una expresión adimensional de dos variedades observables para lograr una similitud: espacial, volumétrica, de fuerza,…, en este caso, hidrodinámica.

1. Para el modelo por adsorción química; utilizando el método de afinidad molecular o iónica, en una columna cromatográfica de afinidad; el análisis dimensional permite utilizar una columna cromatográfica de afinidad como modelo de similitud entre dos comparables: la columna cromatográfica y una asociación reactores de flujo pistón en serie; basándose en el Criterio de suma: tres observables (A1), (A2) y (A3) son comparables con otro observable (A0), mediante las relaciones: A1/A0 = n1, A2/A0 = n2, A3/A0 = n3, si se cumple que, n1+n2 = n3

2. Para el modelo por absorción química utilizando el método de exclusión molecular por gradiente de elución; el análisis dimensional permite utilizar una columna cromatográfica de absorción como modelo de similitud entre dos comparables: la columna cromatográfica y un reactor de flujo pistón; basándose en el Criterio de igualdad: un observable (A) es igual a otro (B), si ocurre: A/B = n; con n=1.

El Flujo Pistón

Recordemos que, el  flujo de pistón es un modelo simple de perfil de velocidades de un fluido que fluye dentro de una tubería . En el flujo de pistón, la velocidad del fluido se supone que es constante a través de cualquier sección transversal del tubo perpendicular al eje de la tubería. El modelo de flujo de pistón asume que no hay capa límite adyacente a la pared interna de la tubería. Para el diseño de reactores químicos de tipo flujo pistón se deben hacer las siguientes consideraciones: esencialmente no hay mezcla; se asume que los «tapones» de fluido pasan a través del reactor en dirección axial; la solución para calcular las ecuaciones diferenciales depende siempre de las condiciones de contorno conocidas, eso da lugar a que deban ser integradas para encontrar la conversión del reactor y la temperatura de salida; otras simplificaciones utilizadas son: flujo axial perfecto y una mezcla homogénea en la estructura de la cama (lecho).

El Reactor Discontinuo de Flujo Pistón (PFR)

El líquido que fluye y pasa a través de un Reactor de Flujo Pistón o PFR (por sus siglas en ingles) puede ser modelado como una serie de «tapones» o láminas cilíndricas infinitamente delgadas; cada una de ellas, con una composición química uniforme; que viajan en la dirección axial del reactor; no obstante, cada tapón tiene una composición diferente a la de los anteriores y a los que le siguen. Otra suposición clave es que, a medida que fluyen las láminas a través del reactor, cada tapón es perfectamente mezclado en la dirección radial; pero no, en la dirección axial (hacia adelante o hacia atrás); es lo que se conoce como mezcla perfecta. De esta forma, cada módulo de volumen diferencial se plantea como una entidad separada con una eficacia infinitesimal de reactor discontinuo cuyo límite tiende a volumen cero. Eso significa que el tiempo de residencia (τ) de cada tapón es función exclusiva de su posición dentro del reactor. En un PFR ideal, la distribución del tiempo de residencia es una función delta de Dirac con un valor igual a τ.

Modelado de un Reactor Discontinuo de Flujo Pistón (PFR)

El balance de materia debe ser aplicado al diferencial de volumen:

Entrada – Salida = Acumulación – Consumo

FA – (FA + dFA) – (-rA) dV = 0 Operando se obtiene:

– dFA = (-rA) dV Por definición, la conversión para reactores de flujo es:

Por lo que, Y     

Sustituyendo: Integrando:

Resolviendo:                               

La ecuación de diseño para un reactor de flujo pistón.

La ecuación del tiempo de residencia τ de un PFR.

La ecuación del tiempo de residencia τ de un PFR cuando la densidad es constante (CAO).

Calculo de la Concentración del Componente A (C(A))

Balance General de Materia: [Acumulación] = [Entrada] – [Salida] – [Producción]

Balance Individual Materia para el Componente i: Fi ( x ) – Fi ( x + d x ) + At dx ν i r = 0.

Donde F i (x) es la concentración molar de la especie i en la posición x,  At es el área de la sección transversal del reactor tubular, dx el espesor diferencial del tapón de líquido y νi es el coeficiente estequiométrico. 

Modelado de un Reactor de Flujo Pistón por Similitud Hidrodinámica con una Columna de Adsorción Química Utilizando el Método de Afinidad Molecular o Intercambio Iónico

La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.

Ligandos de afinidad

Son las moléculas que se anclan químicamente al soporte sólido inerte y las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Se clasifican según su:

Naturaleza: macromolecular o de bajo peso molecular.

Actuación: basada en la selectividad de la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad.

Se distinguen dos grupos:

Ligandos específicos: que como los anticuerpos que se enlazan reversiblemente a un solo soluto.

Ligandos generales: que se enlazan a un determinado grupo de compuestos bioquímicos como las lectinas o nucleótidos.

Cromatografía de Intercambio Iónico

En la cromatografía de intercambio iónico la Fase Estacionaria  es una resina de intercambio iónico; por lo que, se realiza sobre matrices que tienen una carga neta: carga negativa para el intercambio de cationes y carga positiva para el intercambio de aniones. La carga de la matriz de la columna; así como, la carga de la muestra dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). La Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH.

La cromatografía de intercambio iónico se usa generalmente en la separación de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos.

Reactor de Flujo Pistón Isotérmico

Un reactor de flujo pistón isotérmico es aquel en que la temperatura no varía con la posición en el reactor; ésta puede variar con el tiempo por tratarse de un flujo pistón en estado estacionario, pero debe permanecer constante para cualquier posición, a lo largo de todo el reactor. En condición isotérmica, la velocidad de reacción será sólo función de la conversión (o de la concentración) del componente A: Si suponemos que la densidad es constante podemos utilizar como ecuación de diseño:

La integral se puede resolver de manera analítica, gráfica o numéricamente.

Un reactor de flujo pistón isotérmico puede ser modelado como una columna cromatográfica de adsorción, por el criterio de suma, utilizando el respectivo análisis dimensional.

En el caso del diseño de adsorción, el bioreactor se comporta como una columna cromatográfica de afinidad en donde:

· Químicamente el bioreactor se comporta como un reactor enzimático,

· La enzima equivale al biocompuesto o componente activo que se desea extraer.

Para determinar la ecuación de diseño debe encontrar:

· La cantidad de enzima (biocompuesto),

· El volumen de reactor necesario y

· El tiempo requerido para la formación (adsorción) de la cantidad de producto requerido.

En un proceso enzimático la determinación cinética de la velocidad se realiza a partir del valor de Km y Vmax de la enzima (biocompuesto) inmovilizada. Dado que la cinética varía según el bioproceso que se vaya a desarrollar; para efectos prácticos y de modelado se asume que la cinética es de primer orden; con lo que: = concentración de producto. Asumiendo que la estequiometria de la reacción es 1:1 obtenemos: = ecuación cinética de la velocidad.

La ecuación de diseño y por lo tanto el tiempo de residencia (t) están en función de la concentración relativa del substrato limitante de la velocidad (S)

= ecuación de diseño un bioreactor enzimático discontinuo.

Modelado de una Asociación de Reactores de Flujo Pistón en Serie por Similitud Hidrodinámica con una Columna de Absorción Química Utilizando el Método de Exclusión Molecular

La cromatografía de exclusión molecular es una cromatografía que separa las moléculas en solución por su tamaño; no por su peso molecular; generalmente se aplica a grandes moléculas o complejos macromoleculares como proteínas y polímeros; pero variando las condiciones del substrato o gel, se puede aplicar a diversos compuestos orgánicos; siempre y cuando, la mezcla permita el fraccionamiento.

En general.

ü La cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel, separa las muestras en base a su tamaño.

ü La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados.

ü Las muestras de mayor tamaño migran a lo largo de la columna con mayor velocidad que las de tamaño pequeño.

ü Las muestras de menor tamaño, entran en los poros y se mueven a lo largo de la columna lentamente porque tienen que atravesar los laberintos que se encuentran en el interior de las bolas de polímero en su marcha a lo largo de la columna.

Características de las matrices

ü Deben ser estables.

ü Tener bajo contenido en grupos iónicos.

ü Uniformidad de poro y tamaño.

Los compuestos utilizados pueden ser derivados de:

· Dextranos (Sephadex)

· Agarosa (Sepharosa)

· Acrilamidas (Biogel P)

· Esferas de vidrio (sílice)

Cuando se utiliza una solución acuosa para el transporte de la muestra a través de la columna, la técnica es conocida como cromatografía de filtración en gel, para distinguirla de la cromatografía de permeación en gel que se utiliza cuando un disolvente orgánico se usa como fase móvil. Así entonces, la principal aplicación de la cromatografía de filtración en gel es el fraccionamiento de las proteínas y otros polímeros solubles en agua.

Una columna cromatográfica de absorción puede ser modelada como una asociación de reactores de flujo pistón isotérmicos en serie, por el criterio de igualdad, utilizando el respectivo análisis dimensional.

Asociación de Reactores de Flujo Pistón en Serie

El volumen total de una batería de reactores de flujo pistón en serie se comportan como un único reactor de flujo pistón de volumen igual al volumen total de los reactores. Por lo tanto, considerando N reactores tubulares conectados en serie donde las conversiones a la salida de cada reactor son …. Para el componente A.

Analizando el i-ésimo reactor, la ecuación de diseño es: Si es constante en todos los reactores, para N reactores en serie tenemos:

La ecuación de diseño para una asociación de reactores de flujo pistón en serie.

Nota: ф = flujo molar del componente A.

En el caso del diseño de absorción, el bioreactor se comporta como una columna cromatográfica de absorción en donde:

ü El flujo es descendente,

ü El fraccionamiento se basa en la difusión diferencial de las moléculas en los poros del gel,

ü Las moléculas eluyen de la columna en orden decreciente de peso molecular,

ü Las moléculas también eluirán de la columna según su radio de Stokes (aproximación de la esfericidad de la molécula).

Para determinar el peso molecular en proteínas se utiliza el índice de Kovacks: Kd = Ve – Vz / Vp Donde Kd = índice de Kovacks; Ve = volumen de elución de la proteína problema; Vz = volumen intersticial; Vp = volumen del poro. Obviamente, en índice de Kovacks se desarrolló para proteínas; pero la formula es valida para cualquier componente bioactivo; sea proteína o no. El volumen intersticial lo determina la matriz formada por la molécula de alto peso molecular utilizada para crear el lecho sólido que inmovilizará a los componentes activos. Existen en el mercado compuestos cuyas matrices desarrollan volúmenes intersticiales predeterminados; por ejemplo, Sephadex es un gel que forma perlas de un polímero polisacárido con diferentes tamaños de poro: G-10, G-25, G-50, G-75, G-100 y G-200; la notación indica el tamaño de poro. Para lograr mayor resolución se utilizan matrices con propiedades de flujo superiores y/o con resistencia a la presión. Eso se logra creando matrices de composición mixta y mejorando la estructura de las perlas; como ejemplos están: Sepharose (polisacárido), Sephacryl (polímero de polisacárido y bis-acrilamida), Superose y Superdex (polisacáridos). Como se indicó, el volumen de poro es la diferencia entre el volumen total y el volumen de exclusión; para calcular el volumen total se añade a la muestra una molécula de bajo peso molecular; por ejemplo, cromato potásico (194,2 Da). El índice de Kovacks (Kd) obtenido para el biocompuesto determinado se debe incluir en una recta de regresión, calculada a partir de proteínas (biocompuestos) patrones, de peso molecular conocido, para obtener la curva (gráfica) Kd versus Log masa molecular. La resolución en una columna cromatográfica es crítica ya que, una gran resolución soporta un mayor número de platos teóricos por metro de elevación. Un plato teórico es el volumen requerido por una molécula para establecer un equilibrio entre ella, la matriz y la fase móvil en el sistema. Actualmente, las columnas con mayor número de platos teóricos son las de Superdex HR que pueden llegar a 30 000 – 40 000 platos teóricos por metro lineal. Es muy importante dimensionar correctamente la altura de columna cromatográfica ya que, a mayor longitud, mayor número de platos teóricos y por lo tanto, mayor resolución; pero también, la muestra (el substrato crudo) puede quedar muy diluido, lo que disminuye la resolución. Tome también en consideración que, si la matriz puede soportar grandes presiones, los flujos obtenidos serán mayores, lo que aumenta la resolución. En estos casos, se puede implementar una columna de elución al vacío para aumentar la resolución y utilizar una columna de gran altura, llegando a un compromiso óptimo de productividad.

Diseño del Reactor de Flujo Pistón: (semicontinuo)

Al diseñar un bioreactor tubular que funcione en flujo pistón, se debe considerar:

ü Aplicar una presión de vacío pequeña (menor a 10psi de vacío),

ü Alimentar un flujo fresco de substrato crudo,

ü Buscar la solución de compromiso óptima entre la altura de la columna (número de platos teóricos) y la resolución de la matriz de adsorción.

En este caso también debemos asumir que la cinética de la reacción es de orden uno; con lo que la ecuación de la velocidad sería: Donde: V = volumen del reactor; F = caudal o velocidad de flujo.

Para una resolución más práctica desde el punto de vista ingenieril: θ = tiempo de residencia = V/F; ε = eficiencia volumétrica = Vl /Vt; θ = Vl /F = ε Vt /F con lo que la ecuación cinética de la velocidad se transforma en: = ecuación cinética de diseño de un bioreactor enzimático de flujo pistón. Y: = ecuación de diseño de un bioreactor enzimático de flujo pistón.

Diseño en Quimiostato: (continuo)

También es posible diseñar un sistema continuo o quimiostato, si se toman en cuenta las siguientes consideraciones:

ü Aplicar una presión de vacío moderada (-10psia ≥ presión de vacío ≤ -15psi),

ü Alimentar un flujo fresco de substrato crudo,

ü Alcanzar el Estado Estacionario (EE),

ü Operar en Equilibrio Hidrodinámico,

ü Buscar la solución de compromiso óptima entre la altura de la columna (número de platos teóricos) y la resolución de la matriz de adsorción.

Dadas las anteriores condiciones, la ecuación cinética de la velocidad para un quimiostato es:  Donde: D = velocidad o tasa de dilución = F/V.

= velocidad de reacción o conversión.

= ecuación de diseño de un quimiostato.

El tiempo de residencia ya no se denomina así, sino tiempo espacial (t) porque ya no depende del volumen del bioreactor: t = 1/D = µ.

Nota técnica: para poder operar un quimiostato diseñado como bioreactor tubular y no como tanque agitado (condición normal de operación); se debe cambiar la condición de mezcla perfecta lograda por la agitación por una condición de flujo pistón operando bajo una presión diferencial negativa; es decir, vacío. Eso, requiere lograr el equilibrio hidrostático de la presiones para que en el lavado la velocidad de dilución (D) sea la misma que la velocidad de arrastre por vacío; es decir, el flujo volumétrico debido a la succión por vacío. La velocidad de arrastre por vacío debe determinarse una vez alcanzado el estado estacionario (EE) por observación y medición directa (in situ) ya que depende de las condiciones reológicas de mezcla de extractos crudos; así como de la constitución del lecho empacado y de la matriz de adsorción. Por tanto, debe regularse el flujo requerido, ajustando la presión de vacío o succión aplicada a la columna o bioreactor tubular.