Diseño de Foto-Bioreactores para el Cultivo Micro Algas Oleaginosas Parte 1. Teoría y Generalidades

Diseño de Foto-Bioreactores para el Cultivo Micro Algas Oleaginosas

Parte 1. Teoría y Generalidades

Reinhardt Acuña Torres

Introducción

 

1-      Planta Productora de Biocombustibles A partir de Micro algas Fotosintéticas

La crisis del petróleo y la dependencia forzada de los países no productores de petróleo, de los que sí lo producen, afecta no solo a la economía de los primeros; sino también, a su autonomía e independencia alimentaria y productiva. Por esa razón, los biocombustibles alcanzan cada vez una mayor relevancia como combustibles alternativos de menor impacto ecológico. El fitoplancton y una extensa variedad de micro algas fotosintéticas, se caracterizan, aparte de ser el alimento de gran parte de la vida marina animal, por contener (ciertas familias y variedades) grandes cantidades de aceites esenciales de alto a mediano peso molecular. Estos aceites pueden reformados mediante diferentes métodos para obtener combustibles de alto peso molecular y potencial energético y flamante, similar al biodiesel. El objeto de este artículo es dar las pautas de diseño y de operación para la construcción de fotobioreactores destinados al cultivo a gran escala de esos microorganismos fotosintéticos.

 

El Concepto de un Foto Bioreactor para el Cultivo Micro Algas Oleaginosas

 

2- Fotobioreactor Moss con Physcomitrella patens

Un fotobioreactor es un contenedor biológico artificial cuyo ambiente interno es capaz de generar las condiciones necesarias para que la fotosíntesis de las clorofilas existentes en microorganismos, células o tejidos fotosintéticos que en ellos se cultiva, crezca y se desarrollen de manera rápida y eficiente para generar biomasa y los productos metabólicos que se encuentren dentro de ella. En este sentido, el término fotobioreactor se refiere a  sistemas cerrados para el medio ambiente externo; es decir, que no tienen intercambio directo de gases y contaminantes con el medio ambiente externo.

3- Microalgas fotosintéticas

Biotecnológicamente este tipo de bioreactor se utiliza para el cultivo de micro algas con el propósito de fijar CO2 para la producción de biomasa, mediante la reacción de la fotosíntesis que se lleva a cabo por la clorofila que contienen las microalgas. Las microalgas son microorganismos oxigénicos fotoautotróficos que realizan fotosíntesis mediante la siguiente reacción de síntesis:

 

 

El CO2 es el reactivo limitante de la velocidad de reacción en los fotobioreactores cuyo propósito de utilización es el cultivo de microalgas.

El propósito de diseño de estos fotobioreactores es cultivar microalgas (biomasa) para producir aceites esenciales de alto peso molecular (producto metabólico).

Constructivamente existen tres tipos básicos de fotobioreactores para el cultivo de microalgas; siendo que la fotosíntesis es el otro el factor determinante que interviene en el bioproceso, la intensidad de la energía solar disponible es el parámetro unificador. Los tres tipos básicos de fotobioreactores para el cultivo de microalgas son:

 

4- Fotobioreactor panel de platos

Fotobioreactor de Placa: Un bioreactor de la placa consiste en una serie de paneles o placas interconectadas dispuestas vertical u horizontalmente  en cajas rectangulares; a menudo se divide en dos partes para efecto de una agitación con recirculación del líquido (cultivo) del bioreactor. Esas conexiones se utilizan también para realizar el proceso de llenado y vaciado, la introducción de gas (CO2) y el transporte de sustancias nutritivas, fácil. La introducción de los gases de combustión se produce por la parte inferior de la caja o panel, para asegurarse de que el dióxido de carbono tiene suficiente tiempo para interactuar con las microalgas en el seno del líquido del reactor.

 

5- Fotobioreactor tubular vertical

Fotobioreactor Tubular:

Un bioreactor tubular se compone de una serie tubos dispuestos vertical u horizontalmente, conectados a un sistema de tuberías. El cultivo es líquido con biomasa en suspensión (microalgas) y debe ser capaz de circular por la tubería. Los tubos deben estar hechos de material transparente como plástico o vidrio y la circulación se mantiene constante por efecto de una bomba impulsora al final del sistema. El gas (CO2) se introduce al final y al principio del sistema de tubos; de esta forma se evitan los problemas de difusión que ocasionan deficiencia de dióxido de carbono y alta concentración de oxígeno, al final de la unidad durante la circulación del fluido (cultivo).

 

Fotobioreactor de Columna de Burbujas:

 

Un bioreactor de columna de burbujas de fotos consiste en la columna vertical cilíndrica, hecha de material transparente, que permite la introducción de gas, por la parte inferior de la columna, en condición de flujo turbulento (Re>3000), para un óptimo intercambio de gases. 

6- Fotobioreactor de Columna de Burbujas

Este tipo de bioreactores se construyen con un diámetro máximo de 30 cm (el rango es: 20 cm a 30 cm) con el fin de garantizar el suministro necesario de energía luminosa, ya sea de una fuente natural (luz solar) o de una artificial (luz eléctrica). 

 

Los Aspectos Técnicos del Diseño

 

El mayor problema cuando se utiliza luz solar es que ésta es muy variable en intensidad; según sea: la región (latitud), el clima (soleado, oscuro) y la estacionalidad del tiempo (estaciones); eso determina que la construcción esté limitada al tamaño más pequeño de diámetro. No obstante, existen métodos para recoger o concentrar la luz del sol como colectores solares en forma de cono o parabólicos y la transferencia de luz con cables de fibra de vidrio (fibra óptica) que se adapten al perfil del bioreactor. En la gran escala, el consumo de energía debido a las bombas y el costo de fabricación de CO2, pueden pesar más que el CO2 capturado por el bioreactor.

 

En forma general, el diseño de un fotobioreactor para el cultivo microalgas a gran escala, para uso como biocombustible,  debe considerar los siguientes aspectos:

 

ü  Control preciso de la dinámica de fluidos,

ü  Número de Reynolds optimizado,

ü  Control retroalimentado “feedback” de las variables de: turbidez, temperatura, pH, COD, DBO, opacidad, colorimetría, espectro radiometría diferencial de aérea y de inmersión,

ü  Paneles o fuentes radiadores de flujo lumínico homogéneo de alto rendimiento, bajo consumo, larga vida y bajo coste,

ü  Sistemas de microfiltración de fácil limpieza,

ü  Automatización del control de flujo de gases (CO2) y adición de nutrientes,

ü  Precámaras de mezcla y tolvas para la recogida del producto,

ü  Monitorización y control informático computadorizado.

 

Estos aspectos implican 4 diferentes áreas del diseño del fotobioreactor que tienen que ver con:

 

ü  El aprovechamiento de la energía luminosa: ciclos luz-oscuridad, trayectoria de la luz y geometría de fotobioreactores;

ü  Los aspectos fisiológicos: fotoinhibición por oxígeno, cultivos de alta densidad celular, ultra alta densidad celular, heterotrofía y mixotrofía;

ü  Los aspectos hidrodinámicos: número de Reynolds, estrés hidrodinámico, agitación, mezclado y turbidez; 

ü  Los fenómenos de transferencia: masa, calor y momentum.

 

Operativamente, un fotobioreactor para el cultivo de microalgas combina en uno solo, 4 tipos de bioreactores:

 

Un quimiostato: de ambiente químico estático;  es un bioreactor al que continuamente se le agrega medio fresco, a la misma velocidad en el líquido de cultivo, se remueve del sistema, para mantener el volumen de cultivo constante. Su operación está diseñada para que al cambiar la velocidad con que se agrega el medio de cultivo fresco al bioreactor, la tasa de crecimiento del microorganismo se pueda controlar fácilmente. Dado que la tasa de flujo medio se controla para mantener el volumen de cultivo constante, con un flujo continuo, la alimentación (flujo de entrada) y la salida o efluente (flujo de salida), deben ser iguales en un quimiostato.

 

7- Bioreactor de tanque agitado (CSTR) operado como un quimiostato.

Un turbidoestato es un dispositivo de cultivo continuo similar a un quimiostato; su nombre deriva de turbidez estática (ambiente); en comparación con el quimiostato, este bioreactor tiene una retroalimentación entre la turbidez y la tasa de dilución del recipiente de cultivo. La relación teórica entre el crecimiento en un quimiostato y el crecimiento en un turbidoestato es similar, en el sentido de que, ambos técnicamente tienen un volumen fijo y una tasa de flujo fija y por lo tanto, la tasa de dilución es fija. En el estado de equilibrio, cuando las células son uniformes, el funcionamiento de un quimiostato y turbidoestato son idénticos. Es sólo cuando el crecimiento no es homogéneo que las diferencias se hacen manifiestas; eso ocurre cuando las células en crecimiento se encuentran: fuera de equilibrio, están mutando, o están creciendo a su tasa de crecimiento máximo. En este último caso (cuando las células están creciendo a su tasa de crecimiento máximo) es muy difícil establecer el quimiostato a la tasa de dilución constante adecuada; por esa razón, el turbidoestato  utiliza un espectrofotómetro/turbidómetro para medir la densidad óptica del cultivo que se asocia a su densidad celular, para el control de la tasa de dilución constante adecuada. No obstante, existen otras opciones tales como, la permitividad dieléctrica para medir y controlar tasa de dilución en un turbidoestato.

 

Un auxoestato es un dispositivo de cultivo continuo similar a un turbidoestato, se diferencia de éste en que su funcionamiento utilice la información obtenida por retroalimentación de una cámara de crecimiento celular, para controlar: el caudal del medio de cultivo (alimentación fresca), el pH (acidez), la temperatura y el mantenimiento interno (agitación, viscosidad, etc.) a una medida constante. Auxo era la diosa griega del crecimiento de primavera, y como un prefijo representa nutrientes. El uso típico de los auxoestatos es para controlar la acidez (pH) en un cultivo bacteriano con retroalimentación entre la tasa de crecimiento y un medidor de pH, como se observa en la figura. No obstante, en un auxoestato para el cultivo de microalgas deben medirse y controlarse el flujo y concentración del CO2, la intensidad y el periodo de iluminación y la densidad celular del cultivo celular.

 

8- Auxoestato para el cultivo bacterial por control  de pH

 

Operación Continua y Cultivo de Microalgas en un Fotobioreactor

 

Operación Continua

 

9- Esquema de un quimioestato

Para un componente “i” cualquiera de un cultivo celular, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia en el bioreactor: d(VCi)/dt = F1Ci1 – F2Ci + Vrfi – Vrci (1)Donde V es el volumen de cultivo, F1 es caudal de alimentación, F2 el de salida, C_i1 la concentración del componente «i» en la alimentación y C_i la concentración en el caudal de salida; r_fi y r_ci son la velocidad de formación (f) y la velocidad de consumo (c) del componente «i» respectivamente. Bajo el supuesto de que, el cultivo está perfectamente mezclado (mezcla perfecta), se puede asumir que C_i  es idéntica a la concentración que hay dentro del bioreactor. En una operación continua, el volumen varía con en el tiempo, de acuerdo a la ecuación: dV/dt = F1 – F2 (2). En un quimioestato, los caudales  o flujos de entrada y de salida son iguales y dado que el volumen es constante; la ecuación 1 se reduce a: V dCi/dt = F (Ci1 – Ci) + V(rfi – rci) (3).

 

10- Esquema de un bioreactor «fed batch»

Bioreactor de Inóculo

 

Para iniciar un cultivo continuo a gran escala, se debe realizar previamente el inóculo del bioreactor a gran escala, desde un bioreactor a pequeña, dedicado exclusivamente, al cultivo por lotes “batch”. Las microalgas son organismos fotosintéticos autótrofos por lo que, además de luz de calidad para realizar la fotosíntesis, necesitan CO2 como substrato limitante de la velocidad de crecimiento para poder dividirse. Un bioreactor de inóculo para el cultivo de microalgas debe ser por lo tanto, un fotobioreactor alimentado “fed batch” por una corriente S de CO2 como substrato limitante de la velocidad de crecimiento. Una vez establecido el inóculo, se comienza a alimentar con medio fresco a un caudal F, la entrada y a recolectar la biomasa o producto, por un rebalse o lavado; para que se mantenga el volumen constante. En un bioreactor alimentado, el caudal de salida es nulo (F2 = 0) por lo que, el volumen aumenta con el tiempo y en función del caudal de entrada (F1). Las condiciones de operación del bioreactor de inóculo son: F1 = F; dV/dt = F (4) y V dCi/dt = F (Ci1) + V(rfi – rci) (5).

 

El Tiempo de Residencia 

 

El volumen V permanece dentro del operador diferencial pues varía con el tiempo. Por ese motivo, un cultivo alimentado tiene duración limitada en el tiempo que se conoce como tiempo de residencia, ya que, el volumen no puede incrementarse más allá del volumen útil que tiene el bioreactor. El tiempo de residencia (τ) es la cantidad promedio de tiempo que pasa una célula dentro del bioreactor. Esta medida varía directamente con la cantidad de sustancia en el sistema y en su forma genérica está dado por la ecuación: τ = V/F (6). En el caso de “sistemas vivos”, la cantidad de substancia debe transformarse y modificarse por concentración para adaptarse al concepto de sistema biológico, con eso, la ecuación 6 se transforma en: C = Co exp (-kτ) (7). Donde; C = Concentración, Co = concentración inicial, exp = exponencial, k = constante de velocidad de reacción, τ = tiempo de residencia del bioreactor.

 

Ecuaciones y Balances de Materia en el Cultivo Continuo

 

En el estado estacionario la tasa de crecimiento específico (μ) de un microorganismo es igual a la tasa de dilución (D).

La tasa de dilución se define como la tasa de flujo promedio entre el volumen del cultivo del bioreactor: D = F/V (8).

Balance General de Materia: V dCi/dt = F (Ci1 – Ci) + V(rfi – rci) (3)

Balance Materia del Componente X (Biomasa): V dX/dt = -FX + V rfx (9)

Balance Materia del Substrato Limitante de la Velocidad S: V dS/dt = F (S1 – S) – V(rs) (10)

Balance de Materia del Producto P: V dP/dt = -FP + V rp  (11)

 

11- Fases del crecimiento bacteriano

Cinética y Crecimiento Bacteriano

 

Cada microorganismo que crece en un sustrato en particular tiene una tasa máxima de crecimiento específico (μm) que se alcanza después de la fase exponencial de crecimiento, al llegar  la fase estacionaria de crecimiento. Dado que, tasa de dilución se define como la tasa de flujo promedio entre el volumen del cultivo del bioreactor, D define el comportamiento operacional del bioreactor; si se elige una tasa de dilución mayor que μm, habrá acumulación y eventualmente, el volumen del cultivo llegará a ser mayor que el volumen del bioreactor; el cultivo no podrá sostenerse a sí mismo en el bioreactor y habrá lavado; es decir, se removerán las células del cultivo, a mayor velocidad de lo crecen o se reproducen. Cuando la tasa de dilución menor que μm, la acumulación será negativa, las células y el cultivo estarán siempre en su fase exponencial  y no se alcanzará nunca el estado estacionario. Bajo condiciones controladas, las cianobacterias pueden duplicar su población cuatro veces al día. 

 

 

Ecuaciones Cinéticas en el Estado Estacionario

 

El caudal de salida o lavado contiene células maduras y medio de cultivo parcialmente agotado. En base a la ecuación de balance general de materia (ecuación 3), se pueden establecer los balances de materia para: la biomasa X, el substrato limitante de la velocidad S y el producto P.

En el estado estacionario: rX = μm (12). Resulta: F / V = D = μm (13).

La concentración media del substrato limitante de la velocidad S` en estado estacionario es: S` = KsD /  μm – D (14).

La velocidad de consumo de substrato en el estado estacionario es: rs = D (S1 – S`) (15).

El rendimiento celular de biomasa se define como la relación entre la biomasa producida y el sustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y energía): Yx/s = -dX/dS (16).

Por la ecuación (16)  la velocidad de consumo de substrato en función del rendimiento celular de biomasa en el estado estacionario es: rs = μmX / Yx/s (17).

La concentración de biomasa en función del rendimiento celular de biomasa en estado estacionario es: X` = Yx/s  (S1 – S`) (18).

La velocidad de dilución crítica D_c en el estado estacionario es: D_c  = μm S1 / Ks + S1 (19).

K_s se conoce como constante de saturación; el valor de K_s está inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato. Cuando la afinidad del microorganismo por el sustrato es muy alta como ocurre en el cultivo de microalgas, S₁ » K_s y D_c = μm, lo cual es un criterio útil para elegir un valor de D apropiado.

La ecuación de formación de producto en estado estacionario es: P` = rp / D (20). O bien: P` = qpX` / D (21). P es la concentración de producto en estado estacionario.

El rendimiento de producto se define como la relación entre el producto obtenido y el sustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y energía): Yx/s = -dP/dS (22).

 

 

El Cultivo de Microalgas

 

El cultivo de algas es una forma de acuicultura que se ocupa del cultivo de especies de algas, mayoritariamente, microalgas, organismos fotosintéticos autótrofos que forman parte del fitoplancton también denominadas micrófitas. El combustible de algas  es un biocombustible de tercera generación, fabricado a partir de los productos oleaginosos de microalgas; por esa razón, la investigación sobre algas para la producción masiva de aceite se centra principalmente sobre esas especies. Sus principales representantes son las diatomeas y las cianobacterias. La mayoría de las diatomeas son unicelulares , aunque pueden existir como colonias en forma de filamentos o cintas (por ejemplo, Fragillaria ); las diatomeas son los principales productores en la cadena alimentaria; su rasgo característico es que están encerrados dentro de una pared de célula única hecha de sílice (dióxido de silicio hidratado) llamado frustule. A pesar de ser grandes productoras de aceites, el frústule, más bien, la sílice del que está hecho, es un serio inconveniente para una producción industrial de biocombustible, razón por la cual, las diatomeas no son utilizadas para ese bioproceso industrial.

Cianobacterias

Clasificación científica Cianobacterias
Reino:	Bacteria
Filo:	Cyanobacteria
Órdenes
§  Gloeobacterales §  Chroococcales §  Pleurocapsales §  Oscillatoriales §  Nostocales §  Stigonematales

12- Cianobacterias: Croococales

13- Cianobacterias: Lyngbya

 Las cianobacterias (Cyanobacteria, gr. κυανός kyanós, «azul») son un filo del reino Bacteria (único del dominio del mismo nombre) que comprende las bacterias capaces de realizar fotosíntesis oxigénica y a sus descendientes,  los plastos, por endosimbiosis.  Las cianobacterias fueron consideradas durante mucho tiempo como cianófitas (Cyanophyta, literalmente «plantas azules») o cianofíceas (Cyanophyceae, literalmente «algas azules»), castellanizándose el nombre como algas verdeazuladas. Cuando se descubrió la distinción entre célula procariota y eucariota se constató que taxonómicamente son las únicas «algas» procariotas y los únicos procariotas que llevan a cabo fotosíntesis; y el término «Cianobacteria» empezó a ganar preferencia. Actualmente, las cianobacterias son un filo de bacterias que obtienen su energía a través de la fotosíntesis por lo que, también se les denomina oxifotobacterias (Oxyphotobacteria); los análisis genéticos han venido a situar a las cianobacterias entre las bacterias gramnegativas.

14- Cianobacterias: Oscillatoria

La taxonomía de las cianobacterias está actualmente en revisión y dista mucho de ser definitiva. Las croococales (Chroococcales) son un orden de cianobacterias unicelulares que se agrupan en colonias y forman falsos filamentos; no tienen heterocistes  por lo tanto, son incapaces de fijar nitrógeno; con frecuencia poseen revestimientos gelatinosos.  Las oscilatoriales (Oscillatoriales) son un orden de cianobacterias filamentosas sin ramificación, o con falsa ramificación; son carentes de heterocistes y acinetos. Las oscilatoriales incluyen numerosos géneros entre los que destacan Oscillatoria y Spirulina. Oscillatoria es un género de cianobacterias antiguamente incluido en la división Cyanophyta que, junto a la división Prochlorophyta formaban un grupo de procariotas autótrofos.

Establecimiento de Cultivos de Microalgas

 

Se han desarrollado diversos métodos para obtener cultivos monoespecíficos (de una sola especie) y axénicos (libres de contaminantes) de microalgas, que en síntesis se pueden resumir bajo el siguiente esquema.

 

Aislamiento

 

Los métodos básicos de aislamiento para microalgas son:

 

Filtración  

 

Diluciones Sucesivas

 

15- Aislamiento y purificación de microalgas por el método de diluciones sucesivas y subcultivos repetidos.

 

 

16- Método de filtración a través de una columna empacada con algodón.

Purificación

 

Los métodos básicos purificación para microalgas son:

 

17- Purificación de cepas de microalgas mayores de 10μ mediante el método de micropipeta (pipeteo capilar) y cultivos sucesivos.

Pipeteo Capilar: se utiliza para separar microalgas mayores de 10μ: se usa una pipeta de tubo capilar como instrumento para capturar  microalgas, a través del microscopio óptico; luego se separan las células en pequeñas gotas con solución de nutrientes y se colocan alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escavados para que formen cepas. Las cepas seleccionadas son purificadas por cultivos sucesivos.

18- Método de purificación de colonias de microalgas por rayado en placa de agar.

Rayado de Placas de Agar: se utiliza para separar microalgas menores de 10μ: se transfieren pequeñas gotas de plancton con un asa de siembra, extendiendo por estrías (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara con una solución nutritiva para microalgas y con una relación de 1–1.5% w/v de agar disuelto en el medio nutritivo, se incuba la placa bajo iluminación a 18–20°. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado sembrando por estrías o bien, se transfiere a medios líquidos en subcultivos sucesivos para su purificación, de tal manera que en cada dilución se reduzca el número de organismos en una gota, es recomendable combinar la técnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tubo inclinado para obtener cultivos clonajes (de una sola colonia o célula) y poder establecer el cultivo mono específico. Después de 10 días, pequeñas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que se pueden transferir mediante el Método de Hocking o de la micropipeta a medios líquidos.

 

Control Bacteriológico

 

Preparación del Medio de Zobell:
	Tripticasa	1.0 gr
	Extracto de levadura	1.0 gr
	Fosfato Férrico	5 mg
	Agar	15.0 gr
	Agua envejecida (3 meses)	1 litro
	pH = 7.0 – 7.2

Para prevenir el desarrollo bacteriológico en los cultivos de microalgas es necesario determinar la concentración óptima de antibiótico que inhibe el crecimiento de cepas contaminantes; así como el antibiótico ideal para dicho propósito. Para eso, primero es necesario preparar un medio de cultivo como el siguiente:

En Cajas de Petri, con tapa no muy gruesa. Con un asa de Platino picar el agar con la muestra que se desea analizar y colocar a la luz o en una incubadora con iluminación apropiada por un periodo de 2 a 3 días para observar si hay crecimiento bacteriano.

TUBO	1	2	3	4	5
Volumen ml	3.0	2.0	1.0	0.5	0.25
Penicilina µg/ml	12.000	8.000	4.000	2.000	500
Estreptomicina µg/ml	8.000	4.000	2.000	1.000	250

Si el cultivo presenta bacterias se debe realizar un ensayo factorial, sometiendo a la acción combinada de al menos  dos tipos diferentes de antibióticos, se recomiendan tres, en cinco diferentes concentraciones; por ejemplo:

 

Medios de Cultivo para Microalgas

 

Se han desarrollado diferentes medios de cultivo para microalgas cuyas fórmulas tienen diferentes usos o propósitos:

 

ü  Enriquecer el agua de mar natural,

ü  Enriquecer el agua dulce natural, 

ü  Medios artificiales para:

·       Agua de mar

·       Agua dulce

ü  Medios específicos para: especies específicas,

ü  Medios selectivos para especies seleccionadas.

 

Los medios artificiales permiten resultados constantes en contraste con, los medios para enriquecer que tienen resultados variables debido a, entre otros factores, que dependen del lugar y las características del agua donde se colectan y el tiempo de almacenamiento de la misma. El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relación de las condiciones fisicoquímicas del medio; en términos generales los macronutrientes son los factores limitantes del crecimiento y dirigen el metabolismo basal o primario mientras que, los micronutrientes se requieren en cantidades menores y son indispensables para el metabolismo secundario. Los macronutrientes son: el Carbono, Nitrógeno, Fósforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio; en tanto que, los micronutrientes son: Hierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto. Algunos medios de cultivo para microalgas son.

MEDIO CHU 10 MODIFICADO POR GERLOFF
Recomendado para aislamiento de microalgas de hábitats oligotróficos y eutróficos
Ca(NO3)2	0.04%
K2HPO4	0.01%
Na2CO3	0.02%
MgSO4.7H2O	0.025%
Na2SiO3	0.025%
Citrato de Fierro Amoniacal	0.005%
NOTA: Puede usarse para medio solidificado
Agar-Agar	1.0%

MEDIO ENRIQUECIDO
MEDIO MIGUEL (ALLEN-NELSON, 1910)
Solución A:	KNO3	20. 2 g
	H2O	100 ml
Solución B:	Na2HPO412H2O	4 g
	CaCl26H2O	4 g
	HCl conc.	2 ml
	FeCl3	2 ml
	H2O	80 ml
Agregar 2 ml de la Solución A y 1 ml de la Solución B En un litro de agua de mar natural, calentar a 70°C por 20 min.
MEDIO ERD-SAHREIBER ENRIQUECIDO (FOYN, 1934a,b)
	NaNO3	10 mg
	Na2HPO412H2O	2 mg
	Extracto de suelo	5 ml
	Agua de mar	100 ml
MEDIO ERD-SCHREIBER
	*Agua de mar	1 litro
	Extracto de suelo	50 ml
	NaNO3	0.2 g
	Na2HPO4.12H2O	0.03 g

* Se recomienda usar el agua filtrada y pasteurizada y adicionar los ingredientes.

 

MEDIO DE YASHIMA Para cultivo masivo de clorofíceas marinas
Sulfato de Amonio (para la agricultura 21%)		100 g/t
Superfosfato de Calcio (para la agricultura 21%)		15 g/t
Urea (para la agricultura 21%)		15 g/t
Clewat 32		30–50 g/t
Componentes de Clewat 32:
FeCl2 (como fuente de Fe)	0.385%
ZnCl2 (como fuente de Zn)	0.166%
MnCl2 (como fuente de Mn)	0.775%
CoCl2 (como fuente de Co)	0.017%
CuSO4 (como fuente de Cu)	0.007%
(NH4)6Mo7O24 (como fuente de Mo)	0.632%
H3 BO3 (como fuente de B)	2.470%
EDTA	0.005%
MEDIO DE YASHIMA MODIFICADO (HIRATA, 1975)
Medio de Yashima (en la misma concentración)
Peptona	50 g/t
Peptidasa	0.005%
Diaminasa	0.005%
(recomendado para cultivos axénicos)

 

MEDIO DE CULTIVO STEIN PARA AGUA DULCE (Guillard, In: Stein, 1979)

a. Macronutrientes:
	CaCl2.2H2O	36.76 g/l
	MgSO4.7H2O	36.97 g/l
	NaHCO3	12.60 g/l
	K2HPO4	8.71 g/l
	NaNO3	85.01 g/l
	Na2SiO3.9H2O	28.42 g/l

b. Micronutrientes:
	Na2EDTA	4.36 g/l
	FeCl3.6H2O	3.15 g/l
	CuSO4.5H2O	0.01 g/l
	ZnSO4.7H2O	0.022 g/l
	CoCl2.6H2O	0.01 g/l
	MnCl24H2O	0.18 g/l
	Na2MoO4.2H2O	0.006 g/l

c. Vitaminas:
	Tiamina HCl	0.1 mg/l
	Biotina	0.5 g/l
	Cianocobalamina	0.5 g/l

De la solución  a se obtiene 1ml y se  adiciona a 1l de agua esterilizada.

De la solución  b se obtiene 1ml y se  adiciona a 1l de agua esterilizada.

d. Tris:
	Hidroximetil Amino metano	50g/200 ml H2O dest.

De la solución  c se obtiene 1ml y se  adiciona a 1l de agua esterilizada.

De la solución d se obtiene 2 ml y adiciona a 1l de agua esterilizada. Nota: Una vez preparado el medio de cultivo, debe ajustarse de pH a 7.2 con HCl para no obtener un pH ácido.

 

 

Cultivo de Microalgas en Fotobioreactores

TABLA 1 CARACTERISTICAS DE ALGUNAS DE LAS ESPECIES DE MICROALGAS UNICELULARES UTILIZADAS EN ACUACULTURA (COLL-MORALES J., 1983)
GENERO	CICLO DE LUZ	TEMPERATURA OPTIMA	DIAMETRO MEDIO
Phaeodactylum (diatomea)	10 h	25°C	10.4μ
Skeletonema (diatomea)	13.1 h	18°C	>20μ
Dunaliella (cloroficea)	24 h	16°C	17.8μ
Chlorella (cloroficea)	7.7 h	25°C	5μ
Tetraselmis (cloroficea)	18 h	18°C	18.4μ
Monochrysis (crisoficea)	15.3 h	20–25°C	10μ
Isochrysis (crisoficea)	30.2 h	20°C	10.2μ

 

Crecimiento Celular

 

El crecimiento y la división celular de las microalgas son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperíodo (horas de iluminación y obscuridad) en relación con la temperatura como muestra la Tabla 1. La duración del ciclo de luz así como la temperatura óptima son susceptibles de variación de acuerdo con la selección de la variedad (especie).

 

Crecimiento en Biomasa

 

El crecimiento fotosintético en plantas requiere luz, dióxido de carbono, agua y sales inorgánicas para que éstas desarrollen sus sistemas tisulares y cumplan diversas funciones metabólicas. En el caso de las microalgas, casi toda la superficie del microorganismo realiza la función fotosintética, por lo que se obtiene un mayor rendimiento en la función fotosintética (transformación de la energía lumínica a energía química). Esto coloca a las microalgas en la base de la cadena trófica, transmitiendo la energía al resto de escalones.

19- Esquema piramidal de la cadena trófica

El crecimiento medio de las microalgas precisa una serie de elementos inorgánicos básicos y carbono (C) como elemento orgánico principal para constituir la célula. Los denominados elementos esenciales son: carbono (C), nitrógeno (N), fósforo (P), metales; y en algunos casos silicio (Si).

 

Requerimientos Principales de los Cultivos de Microalgas

 

TABLA 2 REQUERIMIENTOS PRINCIPALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS
	REQUERIMIENTOS	COMPUESTOS QUIMICOS	VALORES
Físicos	Luz		2,000 – 4,000 lux
	Temperatura		15 – 22°C
	Salinidad		0.37‰
	pH		7 – 9
	Redox
Nutritivos	C	CO2CO3≃	g/100 ml
	O, H	O2H2O	g/100 ml
	N	N2NH4+ NO3	g/100 ml
	P	PO4≃	g/100 ml
	S	SO4≃	g/100 ml
	Na, K, Ca, Mg	Sales	g/100 ml
	Fe, Zn, Mn, B, Br, Si	Sales	mg/100 ml
	Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Al	Sales	μg/100 ml
	Vitaminas	B12, tiamina, biotina	μg/100 ml

La tabla 2 recoge los principales requerimientos físicos y de nutrición en los cultivos de microalgas, en valores aproximados.

En cada caso particular (especie) se deben establecer las necesidades particulares de la especie que se vaya a cultivar; en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar; para determinar la condición optima de crecimiento. Ciertos nutrientes como el fósforo deben ser suministrados en exceso debido a que, en la mayoría de sus formas, se encuentra como complejos metálicos por lo que, no todo el fósforo es bioasimilable. Si se utiliza agua del mar como soluto, ésta puede ser suplementada con fertilizantes comerciales nitrogenados y fosforados; y con pequeñas cantidades de otros micronutrientes.

 

Control de pH y Dosificación de CO2

20- Sistema de inyección de CO2

En un sistema continuo de cultivo de microalgas el CO2 debe ser suministrado de manera continua; durante los fotoperiodos de horas de luz y controlando su dosificación mediante sensores de pH que minimicen las pérdidas y regulen la acidez. En bioreactores tubulares el pH al final del tubo (reactor) se eleva al disminuir la concentración de CO₂ debido a su alto consumo por parte de los microorganismos algales. La concentración de CO₂ disuelto (COD) puede ser controlada mediante su inyección en las zonas de estancamiento; es decir, donde la concentración ya no permite obtener una capacidad máxima fijadora. El pH se debe controlar junto con el COD debido al que el equilibrio del CO₂ con el agua depende tanto de la temperatura de la acidez del medio de cultivo.

 

Fotosíntesis Oxigénica y Eficiencia Fotosintética

 

La eficiencia fotosintética (EF) se define como la fracción de energía de luz que se fija como energía química durante el crecimiento foto autotrófico. En la fotosíntesis de las plantas, como mínimo se requieren 10 fotones de luz (cuantos) para producir un mol de O2 .Los requerimientos nutricionales mínimos para el metabolismo celular de la mayoría de especies de bacterias pueden ser estimados usando la siguiente aproximación a la formula molecular de su biomasa: C 0.48 – H 1.83 – N 0.11 – P 0.01 (23). No obstante, las microalgas por ser microorganismos autótrofos fotosintéticos, poseen un metabolismo diferente y su composición representativa de la biomasa debe representarse por la siguiente fórmula: CH 1.78 – O 0.36 – N 0.12 (24) que corresponde a los 14 cuantos de fotones necesarios para fijar un mol de CO2 en la biomasa, sobre la base de amonio como fuente de nitrógeno. En esa misma base, un mol de CO2 fijado resulta en un Cmol de biomasa (= 21,25 g de peso seco) con una entalpia de combustión de 547,8 × Cmol kJ -1. En la fotosíntesis normal sólo la luz de longitudes de onda entre los 400nm y 700nm son aprovechables por la planta; esto representa el 42,3% de la energía del espectro total de luz solar y se llama radiación fotosintética activa (PAR); el contenido promedio de energía de los cuantos de luz en ese rango del espectro es de 218 kJ/mol cuanto. En cultivos de microalgas, la combinación activa de todos los elementos, se calcula que como máximo el 9% de la energía solar disponible (teniendo en cuenta todas las longitudes de onda) se puede en convertir en energía química con producción de biomasa nueva; eso significa que el rango de PAR la eficiencia es del 21,4%. La fotosíntesis oxigénica es la modalidad de fotosíntesis en la que el agua es el donante primario de electrones y que, por lo tanto, libera oxígeno (O₂) como subproducto.

La fotosíntesis oxigénica es propia de las cianobacterias y de sus descendientes por endosimbiosis.

 

El Fotoperiodo

 

21- Fotobioreactor vertical en fotoperiodo activo

El fotoperiodo es un factor que regula la división celular, en diatomeas la reproducción asexual (división) ocurre durante el período de luz y éste es acelerado bajo iluminación continua. En contraste las especies formadoras de auxoesporas (esporas sexuales) como las cianobacterias, forman células del mismo tamaño durante el período de obscuridad. Por tanto, el fotoperiodo o período de iluminación debe ajustarse de acuerdo con los objetivos del cultivo; así como, con el espécimen y la variedad que se cultiva. Un fotoperiodo continuo de iluminación prolongada puede producir el crecimiento rápido del cultivo, pero puede afectar a formación de auxoesporas. Un fotoperiodo normal, con horas de luz y obscuridad semejante al fotoperiodo solar, mantiene un crecimiento normal y saludable. En condiciones controladas, un fotoperiodo de 16/8 horas luz/oscuridad ha mostrado ser óptimo para cultivos de cianobacterias, en gran variedad de especies.

 

La Curva Dosis-Respuesta a la Energía Luminosa

22- Respuesta de un ojo humano tipo a la luz

No toda la radiación lumínica (luz) puede ser aprovechada por o en el cultivo de organismos foto-autotróficos.  La tasa de fotosíntesis celular (F) es la capacidad de captación de fotones que tiene una célula fotosintética y depende de la energía luminosa (E) que reciben las células. La radiación fotosintéticamente activa (F/E) es la cantidad de radiación integrada del rango de longitudes de onda que son capaces de producir actividad fotosintética en plantas y otros organismos fotosintéticos como microalgas y bacterias. Ese rango está comprendido entre los 400nm y los 700nm y corresponde también aproximadamente con el espectro visible por el ojo humano.

23-  Curva Dosis-Respuesta a la Energía Luminosa

El  aprovechamiento de la energía radiante durante la fotosíntesis está relacionado con la curva dosis-respuesta que describe esa relación como una respuesta típica del crecimiento celular respecto a la intensidad luminosa. A bajos niveles de intensidad luminosa la rapidez de la fotosíntesis aumenta con la intensidad de luz; pero cuando el nivel de energía incidente supera cierto valor crítico (Ek) la actividad fotosintética decae y solo induce pequeños cambios en F. La constante Ek es específica y característica para cada organismo, e indica el nivel de energía luminosa al que comienza a saturarse el fotosistema del microorganismo. Cuando la energía incidente supera el nivel crítico, el efecto causa la inhibición de los fotosistemas celulares; lo cual, puede ocasionar el deterioro del cultivo celular e incluso causar un daño irreversible.

 

Eficiencia y Eficacia Luminosa

 

La eficacia luminosa de la radiación (κ) mide la parte de energía electromagnética que se usa para iluminar y se obtiene dividiendo el flujo luminoso (F) entre el flujo radiante (φ), κ = F/φ (25). En el sistema internacional SI la eficacia luminosa se expresada en lúmenes por vatio (lm/W). La eficacia luminosa tiene un valor máximo posible de 683 lm/W que para el caso de la luz monocromática corresponde a una longitud de onda de 555 nanómetros (verde).

La eficacia luminosa de una fuente de luz (η) o rendimiento luminoso mide la parte de energía eléctrica que se usa para iluminar y se obtiene dividiendo el flujo luminoso emitido (F) entre la potencia (P) eléctrica consumida, η = F/P (26).

Por otro lado, la eficiencia luminosa (F/E) mide la eficiencia con la que la luz incidente es utilizada por la célula o  el microorganismo fotosintético; es decir, la fracción de energía luminosa incidente que es convertida a energía química por el fotosistema.

 

Unidades de fotometría del SI
Magnitud	Símbolo	Unidad del SI	Abrev.	Notas
Energía luminosa	Qv	lumen segundo	lm·s	A veces se usa la denominación talbot, ajena al SI
Flujo luminoso	F	lumen (= cd·sr)	lm	Medida de la potencia luminosa percibida
Intensidad luminosa	Iv	candela (= lm/sr)	cd	Una unidad básica del SI
Luminancia	Lv	candela por metro cuadrado	cd/m2	A veces se usa la denominación nit, ajena al SI
Iluminancia	Ev	lux (= lm/m2)	lx	Usado para medir la incidencia de la luz sobre una superficie
Emitancia luminosa	Mv	lux (= lm/m2)	lx	Usado para medir la luz emitida por una superficie
Eficacia luminosa	η	lumen por vatio	lm/W	razón entre flujo luminoso y flujo radiante